一、實(shí)驗(yàn)原理

　　活性氧簇ROS是由氧分子還原所形成的分子或者離子，大部分都是由線粒體產(chǎn)生的副產(chǎn)物，它們會(huì)在細(xì)胞代謝包括細(xì)胞內(nèi)呼吸和底物氧化過程中產(chǎn)生。適量的ROS是細(xì)胞必需的，因?yàn)镽OS參與維持細(xì)胞存活及生理功能所需的各種生活過程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)，但過量或過少的ROS都會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，破壞核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和細(xì)胞膜等，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織破壞。

　　DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后，被水解生成DCFH。而DCFH不能透過細(xì)胞膜。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。DCF被488nm激發(fā)光激發(fā)后，發(fā)射530nm的熒光信號(hào)，被FITC通道接收，檢測DCF的熒光就可以判定細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的水平。

　　二、實(shí)驗(yàn)步驟

　　1、收集細(xì)胞：細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1500 rpm離心5 min收集細(xì)胞,棄上清。

　　2、PBS洗滌細(xì)胞：加入3ml 4℃預(yù)冷的PBS完全重懸細(xì)胞，1500 rpm離心5 min，棄上清。沉淀震蕩混勻。

　　3、細(xì)胞計(jì)數(shù)：移取10 ul在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞為1×10^6-2×10^8/ml。

　　4、裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10umol/L。

　　5、孵育探針：37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔3-5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸，用無血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針。

　　6、上機(jī)檢測：流式細(xì)胞儀使用激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525±20nm進(jìn)行檢測，用FlowJo軟件分析細(xì)胞ROS水平。

　　三、結(jié)果分析

　　結(jié)果說明：平均熒光強(qiáng)度值越大，表明細(xì)胞內(nèi)ROS含量越高。